结构生物学的“圣杯”，1亿道尔顿的核孔复合体结构首次呈现——专家点评
BioArt按
近日，Nature杂志罕见地发表了一篇有5位通讯作者参与的结构生物学论文，这篇论文所解析的蛋白复合体结构称得上是结构生物学的“圣杯”。施一公教授在获得2017“未来科学大奖”后接受王皓毅博士采访，被问道“剪接体这个战役将来完成的时候，对您个人来说最有趣、最重要的结构生物学问题会是什么呢？”他在回答中谈到，“英国的著名学术期刊《自然》为庆祝X-射线晶体学百年发表了一篇评论，在结尾一段提出了结构生物学的两大‘圣杯’：一个就是剪接体，那位写评论的作者可能悲观了一些，没想到一年之后我们就把剪接体的高分辨率结构做出来了；另外一个叫核孔复合体，其分子量超过1亿道尔顿，有剪接体的几十倍......这个复合物是目前结构生物学的另外一个重大悬而未决的问题，世界上很多的实验室已经在对这个问题进行攻关”。想不到，一年未过，核孔复合物的结构研究就取得了里程碑式的重大进展和突破，虽然其整体分辨率相对剪切体而言目前看来似乎还比较低，但是迈出了关键的第一步之后，相信随着技术和方法学的进步我们在不久的将来就能看到更清晰的核孔复合体结构。为了使读者能够清楚地了解本次工作的重要意义，BioArt不仅邀请了专业人士进行解读，还特别邀请了德克萨斯西南医学中心长期从事细胞核运输复合体研究的Yuh Min Chook教授（博后期间曾在核孔复合体研究先驱Günter Blobel教授实验室进行相关研究）进行点评，以飨读者！
撰文丨 倪冬春（博士）、 黄彬璐（博士）
点评丨 Yuh Min Chook（教授）
责编丨 迦 溆
核孔（Nuclear pore）在现代生物学中是一个非常著名的亚细胞结构，负责细胞核内外的物质运输。可以说核孔复合物（Nuclear pore complex, NPC）是已知的细胞中最大、最复杂的蛋白质复合体了，并且在不同的生物体中，NPC的尺寸并不完全相同。如今，对于很多结构生物学家来说，对核孔复合物结构的研究已经不仅仅是探索自然的好奇心和对生物学意义的追求，也不是为了诺斯卡小金人，而是人类对极限和征服的一种渴望与本能。
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=o1337dwyd0v&width=500&height=375&auto=0Protein Export Through the Nucleara Pore Complex
来自美国洛克菲勒大学、UCSF、波斯顿大学、贝勒医学院等单位和科研人员合作在近期的Nature杂志上以长文的形式发表了一篇题为Integrative structure and functional anatomy of a nuclear pore complex 的文章（Article），报道了酵母Yeast细胞核孔复合物低分辨率冷冻电镜结构，并且文章罕见地出现了五位通讯作者（据悉，Nature杂志一般不会超过3位通讯作者，结构生物学的论文出现5位通讯作者实属罕见），分别是洛克菲勒大学Michael P. Rout和Brian T. Chait、UCSF的Andrej Sali、波斯顿大学Christopher W. Akey和贝勒医学院的Steven J. Ludtke 。
谈核孔复合物，要从真核生物说起。真核生物，相较于原核生物，顾名思义，根本性的区别就是真正意义上细胞核的出现。细胞核与细胞质的分离，使得细胞得以在不同时空精确独立控制转录与翻译。那么可以想象，围绕细胞核的这层膜至关重要，也许因此进化出细胞核膜是一个双层膜结构？这种隔离无疑是重要的，但联系与交流也必不可少，也就是所谓“融会贯通”：细胞膜上的NPC就是介导细胞核质间mRNA和蛋白质转运的唯一通道。所以，研究NPC及细胞核质转运（Nucleocytoplasmic transport, NCT）的意义就不言自明了。
1949年，Callan观察在两栖动物细胞核膜时发现，细胞核膜是双层膜结构，不是平滑而是多孔的结构(Callan et al., 1949)。十年后，Watson第一次提出细胞核孔复合物（Nuclear pore complex, NPC）的概念，指出NPC类似圆柱结构，突向细胞核和细胞质两端。基于此，他强调穿过NPC的物质应该不是随机而是被调控的(Watson, 1959)。如今，我们清楚，NPC确实是巨大的复合物，哺乳动物细胞的核孔复合物相对分子质量高达120 多兆dalton，直径约120纳米，由30多种蛋白（Nucleoporin, Nup）组成一个八重对称的结构，可以说是细胞内最大的蛋白质复合物 (Beck and Hurt, 2017)。分子质量小于 40 kD 或者 5 nm 的蛋白可以自由通过NPC；如果大于此阈值，在经典的转运模型中，只有携带信号肽（Nulcear localization Signal, NLS）的蛋白，才能够被转运蛋白Karyopherin/Karyopherin 1 （Kap, also known as importin）识别并形成复合物。由于这些转运蛋白含有疏水结构，它们结合NPC中同样具有疏水性的FG-Nups （Phenylalanine-Glycine repeats），从而顺利通过NPC。研究表明，这些转运蛋白可以与NPC结合并维持调控NPC的通透性permeability (Kapinos et al., 2017; Lim et al., 2015)。
本次发表的文章中，研究人员利用一种区别于常规单颗粒重构的冷冻电镜技术，冷冻断层成像（Cryo-ET）的策略，对酵母细胞核孔复合物的结构进行了研究，解析了酵母细胞552个蛋白分子组成的核孔复合物结构（文章中的说法）。由于本次所获取的电子密度图分辨率并不是很高，只有28Å（注：内环20Å），因此还需要使用过去已经发表的结构以及其它的生物信息学手段来定位和模拟NPC各个组成分子之间的堆积方式。文章还基于结构和以往的认识，对核孔复合物相关的生物学事件做了一些探讨(Seung et al, 2018)。文章比较了酵母与人源的核孔复合物结构上的差异，发现酵母NPC尺寸相对较小，结构紧凑，而人核孔复合物相对疏松。比较有趣的是关于FG-Nups的认识，FG-Nups实际上是非常柔性的，像绳子一样拴在核孔复合物中央孔道内壁。上面提到它们可以与核转运因子结合并调控运输进程。研究人员发现在NPC中间有上下两团较强的电子密度，而FG-Nups锚定的位点在孔道的内侧，指向孔道的中央。因此推测这段较强的密度是由FG-Nups与转运因子等共同形成。
图2
结构生物学是一种非常依赖于技术革新的学科。无论是X射线衍射，核磁共振还是如今十分热门的冷冻电镜技术，其背后都有一个不断完善并发展到极致或将要发展到极致的历程。2017年的诺贝尔化学奖颁给了在冷冻电镜技术领域有突出贡献的三位科学家（见BioArt特约评论丨2017年诺贝尔化学奖评述——冷冻电镜技术获奖并不意味着该技术已经成熟）。在电镜技术还没有如此强悍之前，由于技术上的瓶颈，解析完整的NPC高分辨率结构是不可以想象的事情。然而晶体学作为过去最重要的手段，却几乎把所有组成NPC的亚基分子统统解析了一遍。这也是为什么虽然此次的电子密度图分辨率很低，却也还可以绘制出NPC全复合物结构，当然这并不完全精确。
然而即便是今天我们可以使用冷冻电镜这种手段，解析核孔复合物的高分辨率结构也绝非易事。除了硬件技术上的限制，样品的制备也是关键。最近几年我们看到结构生物学有了井喷式的成果，从小蛋白到大蛋白，从膜蛋白到亚细胞结构，一系列非常有难度的生物大分子结构相继发表，这很大程度上是由于技术瓶颈的打破和晶体学时代的遗留下来的红利。我们的前辈对提取和分离一些细胞中超大复合物的方法在过去20多年里已经有着非常深入的探索。然而大多数蛋白质复合物与核孔复合物相比，纯化上还是相对简单的。
核孔复合物是一个巨大的蛋白质复合体，无法通过传统的过表达方式来获取。你可以说它是一个膜蛋白复合体，可它却是一个非常尴尬的膜蛋白复合体。它与核膜的双层膜结合，跨膜方式也区别与常规的整合膜蛋白。所以你可以设想，提取NPC完整的复合体并不是那么简单，并且提取的过程中很容易破坏它颗粒结构的完整性。同时还存在一个非常关键的问题，就是冷冻电镜制样的问题。冷冻电镜一般需要将样品冻在一层薄薄的非晶质冰中。由于核孔复合物太过巨大以及它形状的扁平，会使颗粒取向上的单一，导致在三维重构的过程中出现严重的问题，这或许也是为什么研究人员并没有使用常规的单颗粒重构而是Cryo-ET的方法来采集NPC颗粒的图像了。不过如今似乎多了一种选项，利用Cryo-ET可以对完整细胞或细胞核膜进行直接的数据采集，虽然还尚未成熟，但这却是一项对整个生物医学领域有着非凡意义的方法学。
笔者对本次所解析酵母核孔复合物低分辨率结构的这一事件一点儿也不感到意外。 这里不得不提到一个人，今年二月份刚刚过世的洛克菲勒大学的Günter Blobel教授（缅怀丨诺奖得主、“信号肽假说”提出者Günter Blobel）。Bolbel教授可以说是核孔复合物结构与功能研究，甚至是分子细胞生物学领域的开拓者之一，于1999年获得诺贝尔生理与医学奖。Bolbel教授开始对核孔复合物的提取工作要追溯到上世纪70年代。而此次发表文章的通讯作者最后一位Michael P. Rout教授也正是Bolbel教授90-97年间的博士后。1999年他们在The Journal of Cell Biology杂志上共同发表了题为 Isolation of the Yeast Nuclear Pore Complex 的文章（笔者水平不行，亲测实验重现失败）。说到这儿，似乎就会明白，这是一项已经延承了几十年的工作。或许此篇Nature文章也算是对导师的一种缅怀和致敬吧。
说到核孔复合物结构的研究还需要提起另外一个人， Martin Beck教授。 Martin Beck带领的团队在2015年发表了人源核孔复合物低分辨率（23Å）in situ 电镜结构，内环21Å（2016年），35Å（2013年）。
对核孔复合物结构的执着就像是一场接力赛，其实与其他领域也是相似的。只不过与所谓的生物学问题和精准药物等意义相比，解析NPC结构这件事儿本身或许更能够让结构生物学家们兴奋，这也未尝不是一种探索欲。目前数据库中已有的核孔复合物的结构分辨率还不足以搭建十分精确的结构模型。不过笔者认为，在未来两到三年甚至更短的时间里，核孔复合物将会被解析到近原子或原子分辨率，从技术上来说不是问题。并且我国科学家也很有可能在这场“竞赛”中取得优异成绩。
注：1Å=0.0000000001米
专家点评
Yuh Min Chook, Ph.D., Professor（Department of Pharmacology & Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center）
Comments：The Kim et al. paper, the result of collaboration between the Rout (Rockefeller University), Sali (UCSF), Chait (Rockefeller University), Akey (Boston University School of Medicine) and Ludtke (Baylor College of Medicine) groups, presents the highest precision and most complete integrative structural model of the S. cerevisiae nuclear pore complex (NPC). This structure is based on the highest resolution electron tomography structure (28 Å resolution overall; 20 – 25 Å resolution for the inner ring) of the yeast NPC, resolution equivalent to that of a previous electron tomography structure of vertebrate NPC (Beck group, 2016). The integrative structure (precision is 9 Å), which resolves 552 nucleoporins (Nups) or NPC proteins, also includes information on mass of the NPC and stoichiometries of every Nup from mass spectrometric and imaging data, proximity/orientation information from cross-linking mass spectrometric data, and conformation information from many SAXS profiles of nucleoporins. This is the most complete NPC structure so far, largely because of (i) much better preservation of the NPC due to a method of isolation that is much gentler and faster, and (ii) better resolution electron tomography. Unlike previous structures such as the 2016 ones from the Beck group and the Hoelz group, which resolved the scaffold or the symmetric core of the NPC, the Kim et al structure resolved the whole portion of the NPC that sits between the outer and inner nuclear membranes (or the entire NPC, minus the very dynamic cytoplasmic fibrils that protrude into the cytoplasm and the nuclear basket that protrudes into the nucleoplasm) including the cytoplasmic RNA processing platform, basket anchors, details of the scaffold such as the connectors that tie together all the major modules in the NPC, the ring of pore membrane, the ring of transmembrane protein POM152, and density in the central transporter that reflects nuclear transport factors with transport cargos going through it. Density had never been observed in the central transporter in previous electron microscopy/tomography structures, and the connecting arches of IgG repeats of POM152 that bridge to the neighboring POM152 through the NE lumen membrane ring was also never seen before. Membrane-binding Nups are strategically placed to both stabilize the curvature of the pore membrane and clamp the NPC to the nuclear envelope.
致谢：感谢上海科技大学助理教授廖军博士在推荐点评专家过程中的重要贡献！
参考文献
1. Beck, M., and E. Hurt. 2017. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nat Rev Mol Cell Biol. 18:73-89.
2. Callan, H.G., J.T. Randall, and S.G. Tomlin. 1949. An electron microscope study of the nuclear membrane. Nature. 163:280.
3. Kapinos, L.E., B. Huang, C. Rencurel, and R.Y.H. Lim. 2017. Karyopherins regulate nuclear pore complex barrier and transport function. J Cell Biol. 216:3609-3624.
4. Lim, R.Y., B. Huang, and L.E. Kapinos. 2015. How to operate a nuclear pore complex by Kap-centric control. Nucleus. 6:366-372.
5. Watson, M.L. 1959. Further observations on the nuclear envelope of the animal cell. J Biophys Biochem Cytol. 6:147-156.
6. Kim SJ et al. 2018. Integrative structure and functional anatomy of a nuclear pore complex.Nature.555, pages 475–482
BioArt，一心关注生命科学，只为分享更多有种、有趣、有料的信息。关注请长按上方二维码。投稿、合作、转载授权事宜请联系微信ID：fullbellies 或邮箱：sinobioart@bioart.com.cn